600 оттенков кумасси
Длинный пост для всех любителей красить форезные гели!
Что вы знаете о настоящей душности щепетильности в проверке методов окраски гелей? А вот в работе Neuhoff с коллегами (1985) ученые проверили 600 (!) вариантов окрашивания 3 белков в гелях с несколькими концентрациями 2 красителей (Coomassie Brilliant Blue R-250 и G-250) с различными сочетаниями кислот и добавок.
Состав растворов для окраски изобилует всякой экзотикой - тут не только классические метанол и уксусная кислота, но и соляная, хлорная, ТХУ, фосфорная, аскорбиновая, щавелевая и другие кислоты (14 шт., да еще и в разных концентрациях!). Среди добавок - ЭДТА, глицерин, ПЭГ, ДМСО, различные соли (13 шт.!) и другие добавки.
Дотошность авторов проявляется еще и в том, что красители, которые использовались для окрашивания они дополнительно чистили (уверен, никто этого не делает!).
Как же у них получилось провести так много экспов и не сойти с ума? А фишка в том, что красили не гели после фореза, придумали имитацию геля. Вначале тестили кислоты в тонком слое агарозы - делали отверстия и заливали туда растворы белков в агарозе. Поверяли интенсивность окрашивания и фон. А потом отобранные кислоты проверяли на барби-сайз ПААГ. Заливали очень тонкий полиакриламидный гель (0,5 мм) в кассету из предметных стекол, в лунки заливали растворы белков в акриламиде/бис. Потом красили, отмывали и детектировали на самодельном денситометре. Обращаю внимание, что это 1985 год и до появления биорадовских гельдоков оставалось еще 10 лет!
Итак, что полезного можно отметить:
1. При окраске важен pH (а значит и кислота, которая применяется).
При pH <1.5 белки протонированы и хорошо окрашиваются при минимальном фоне, при pH >2 условия окрашивания менее благоприятные и кумасси красит также и гель. При pH <0.5 окраска проходит плохо, потому что краска начинает осаждаться и раствор истощается.
Наилучшие условия для окрашивания обеспечивает промежуточный диапазон pH, при этом краситель находится в коллоидной форме, не выпадает в осадок и доступен для окрашивания (коллоидный кумасси красит лучше обычного, мы это и раньше знали).
2. При низком pH кумасси деградирует и поэтому при приготовлении коллоидного красителя нужно добавлять до 2-6% сульфат аммония, он работает как буфер. В результате pH становится 1.5-2.0, это как раз компромиссное значение, когда и краска не портится и белки хорошо протонированы. Кстати, из-за нестабильности кумасси при низком pH рекомендуют использовать свежий раствор в протоколах, где есть сильные кислоты (хлорная, ТХУ).
3. Для долговременного хранения лучше отмыть гель от кислоты, нейтрализовать в буфере, смыть слой прилипшего коллоидного кумасси 25% метанолом и хранить в 20% растворе сульфата аммония. Сульфат аммония стабилизирует комплекс кумасси с белком и полоски меньше выцветают (если сосуд неплотно закрыт концентрация сульфата аммония будет повышаться и гель скукожится). Если нужно гель сушить, то нужно отмыть от соли и уравновесить в 2-4 % глицерине.
4. Окраска получается лучше, если фиксировать в 12% ТХУ - позволяет убрать интерферирующие соединения (например SDS). Но авторы отмечают, что для разных белков лучше подбирать свой вариант фиксации (кто-нибудь такое делает, интересно?)
5. Добавление сульфата аммония в раствор для окраски позволяет уменьшить окрашивание фона (лучше всего до 10%, выше краска осаждается).
6. R250 тоже может быть в коллоидной форме (для меня это было открытие!). G250 можно получить в коллоидной форме без орг. растворителей, для тех, кому мешает запах спиртов это выход. Но в следующей работе авторы отмечают, что со спиртом быстрее и лучше красит.
7. Гели можно красить ступенчато - вначале прокрасить мажорные полоски, зафиксировать в 20% NH4SO4 , снять на гельдоке, потом удалив NH4SO4 добавить свежую краску и прокрасить слабые полоски
8. Если хотите блеснуть в приличном обществе, можно сказать не «как хотите, так и делайте», а многозначительно указать на латыни “Ad libitum” (по собственному усмотрению).
Титанический труд!
Энжойте и восхищайтесь
